多孔钛合金表面处理及生物学性能研究

发布日期：2024-4-10 14:48:10

Ti6Al4V合金因具有优异的力学和生物学特征而在骨植入物和骨组织修复领域备受关注 [1] 。但是，Ti6Al4V合金材料导热系数小，弹性模量低，这使得传统制造技术难以满足复杂Ti6Al4V合金精密零件的制作要求 [2] 。随着先进成型技术的快速发展，增材制造技术为上述问题提供了理想的解决途径。激光粉末床融合技术（Laser Powder Bed Fusion, LPBF）具有加工分辨率高、设计灵活、成形稳定、结果可预测等特点，是目前制造金属部件最普遍采用的增材制造技术，能实现复杂多孔金属材料的制备，可为患者提供“量体裁衣”式的骨科治疗方案 [3] 。

钛合金骨植入物的生物惰性是限制其临床应用的主要因素 [4] ，因此应对其表面进行改性处理，以提高其生物活性，促进植入物与天然骨组织形成充分的骨整合 [5] 。钛表面形貌可以通过多种改性方法改善 [5-10] ，目前广泛采用的方法大致分为：物理处理法、化学处理法和生物处理法。其中，化学处理法操作简单，易在材料表面形成均匀涂层，结构和成分与自然骨相似，并且对于多孔结构而言，化学处理可使涂层均匀覆盖在复杂孔洞表面，是一种最适用的表面处理方法 [11] 。化学处理方法又包括酸蚀处理、碱热处理、阳极氧化、微弧氧化等，是目前的研究热点。本研究选用了经济有效的碱热处理方法，经碱热处理后多孔钛表面生成了一层具有生物活性的物质，再诱导类骨羟基磷灰石沉积，提高了惰性生物材料的生物活性，并且不损害材料本身的良好性能 [4,12-14] 。但是，以往的研究表明，在碱热处理过程中，材料表面的钛酸钠纳米线易聚集为片状，分布不均且易产生裂纹，降低了表面改性产生的生物活化效率，这对后续羟基磷灰石沉积、细胞的粘附和增殖都将产生不良影响 [15] ，甚至会影响材料的整体力学性能。因此，探究合适的碱热处理参数是提高经表面处理后材料生物活化效率的关键。

本研究通过优化碱热处理的工艺参数，在Ti6Al4V多孔钛合金表面成功制备了分布均匀、大小适中且无裂纹的网状纳米结构涂层，并对此活化层的成分进行了分析；将表面改性后的样品经模拟体液浸泡，使其表面形成多层次的纳米结构涂层，并对样品进行体外细胞实验，考察其对成骨细胞粘附、增殖和分化过程的影响。

1 、实验部分

1.1 样品设计与制备

多孔钛合金的单元结构特征和孔隙率参数是调节其力学和生物学性能的关键因素 [16] 。

因六方金刚石结构具有强度高、稳定性强等性能特点 [17] ，在3-matic（Materialise）软件中，以六方金刚石结构为基本重复单元，设计了小梁直径为0.37 mm，孔隙率为70%的TiS圆柱（Φ 6 mm × 10 mm），模拟松质骨的孔隙度及几何形状特征。以Ti6Al4V合金粉末（粒径15~53 μm）为原料，利用LPBF技术制备上述设计尺寸的Ti6Al4V多孔钛合金试样。打印参数：激光功率150 W，扫描速度1250 mm/s，铺粉厚度0.03 mm，扫描间距0.05 mm。经准静态压缩实验测试得知，所制备的多孔钛合金样品的弹性模量为2.815 GPa，抗压强度为95.008 MPa，可满足人骨对骨替换材料的力学要求。

1.2 表面处理与细胞活性测试

分别配制3 mol/L和7 mol/L的NaOH溶液，备用。烧杯中加入适量37% HCl溶液，将试样完全浸润其中，在水浴条件下50 ℃保温60 min后取出，用大量去离子水和乙醇溶液超声清洗、烘干。将试样分别放入离心管中，加入适量3 mol/L或7 mol/L的NaOH溶液，水浴条件下60 ℃保温1、4和10 h，具体实验参数见表1。试样取出后，用大量去离子水和乙醇溶液超声清洗、烘干。最后，将试样放入卧式炉中，通氩气保护，在600 ℃下保温30min，随炉降温后取出。采用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）表征样品。另外，为了表征涂层，采用线切割将试样轴向切开，使用SEM和EDS分析切面涂层。

选用最佳碱热处理参数对样品进行表面改性处理后，将样品在37 ℃恒温条件下置于模拟体液（SBF）中浸泡10 d（每48 h更换1次SBF），SBF成分如表1所示。取出浸泡后的试样，放入烘干箱内70 ℃烘干24 h以上。为方便区分，对不同方式处理的试样分别命名：将六方金刚石结构多孔钛合金材料命名为TiS，将经过碱热处理的六方金刚石结构多孔钛合金材料命名为TiS-A，将经过碱热处理并在模拟体液中浸泡10 d的六方金刚石结构多孔钛合金材料命名为TiS-A SBF采用TiS、TiS-A和TiS-A SBF 这3组样品，每组准备3件试样进行细胞培养实验。由于所设计的植入物主要针对骨创伤或疾病引起的骨缺损，因此选择骨髓间充质干细胞（hBMSC）采用直接接触的方式培养到样品上。

按照iCell原代间充质干细胞无血清培养体系（PriMed-iCell-012-SF）配制，hBMSC细胞在5% CO₂ 、37 ℃恒温培养箱中培养。实验分为Control组和待测样品组，其中，Control组每孔加入1000 μL 细胞悬液；待测样品组先加入经过121 ℃高温高压蒸汽灭菌处理20 min后的样品，再在每孔加入1000 μL细胞悬液。每个处理组均做3个复孔。取对数生长期的hBMSC细胞进行细胞计数，调整细胞浓度，采用直接接触的方式，将hBMSC在48孔板钛合金材料上接种2 × 10 4 个细胞，在5% CO₂、37 ℃恒温培养箱中培养48 h。采用磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗各孔3次，每孔加入1000 μL含10% CCK-8的培养基，再放入5% CO₂、37 ℃恒温培养箱中培养2 h。最后采用酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

细胞经48 h培养后，采用活细胞/死细胞染色试剂盒对样品进行染色，评估细胞存活力：荧光染料钙黄绿素（Calcein-AM）染色活细胞呈绿色，荧光染料PI（碘化丙啶）染色死细胞呈红色。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察染色样品。

2、结果与讨论

2.1 钛合金表面处理后的微观组织表征

酸蚀预处理能够去除钛合金表面的污染物和氧化层。碱热处理过程中，通过HTiO₃^-和HTiO₃ ‒ •nH₂O吸引Na⁺ 在表面生成网状的钛酸钠凝胶层，再经高温烧结，表面脱水形成钛酸钠。采用不同的实验参数对钛合金表面进行处理后，以电镜观察其微观组织。如图1所示，采用不同参数对钛合金表面改性后，试样表面均形成了纳米线结构，并且未产生裂纹。当采用3 mol/L NaOH溶液时，在短时间内钛合金表面呈现纳米网状结构，随着时间延长，纳米线直径变粗并呈现团簇状；NaOH浓度增至7 mol/L有利于钛酸钠纳米线迅速生长及密度增大，随着时间延长，钛合金表面聚集为纳米片状结构，中心容易形成大的孔洞，分布不均匀。

对钛合金表面形貌进行能谱分析，以 7 mol/L NaOH 溶液 60 ℃保温 1 h 的处理方式为例，如图 2 所示，试样表面主要元素为 Na、O、Ti、Al、V。切割样品对涂层进行电镜观察（图 3），可见 Al和 V元素分布在整个涂层中并呈现出微小的波动，在边界处 O元素出现明显聚集。

钛-3.jpg

综上可知，采用高浓度碱溶液经短时间保温处理的钛合金试样具有网状结构有序、大小适中且分布均匀的表面形貌，可以为羟基磷灰石沉淀提供成核位点，促进细胞代谢过程的营养和氧气交换，并为骨长入和骨整合提供适当的空间 [18] 。本研究表明多孔钛合金经过酸洗预处理，用 7 mol/L NaOH溶液在 60 ℃下保温 1 h 后，再经 600 ℃烧结 30 min 为最佳表面改性工艺，模拟体液浸泡实验在此工艺下进行。

经过最佳表面改性工艺处理后，试样经SBF培养10d，表面出现羟基磷灰石沉积涂层及白色花状沉淀，如图 4所示。

在模拟体液浸泡过程中，碱处理后钛合金表面的 Na + 与 H₃O⁺ 进行离子交换，使得钛合金表面 pH 值增加，提高了 Ca²⁺ 和 PO₄3‒ 活性，从而促进了磷灰石的形核；钛合金表面形成了 Ti‒OH 官能团，能够吸引模拟体液中的 Ca²⁺，提高钛和钛合金表面的 Ca ²⁺ 和 PO₄3‒ 的过饱和度。碱处理后，钛合金表面呈多孔网络结构，TiO₂的密度增加，为磷灰石提供了优越的异质形核位置，促使磷灰石从模拟体液中快速沉积出来而形成羟基磷灰石涂层。

2.2 多孔Ti6Al4V合金材料的生物学性能

为了评价多孔 Ti6Al4V 合金材料的生物相容性，从细胞形态和细胞相对活性两个方面进行了考察。

采用直接接触的方式将骨髓间充质干细胞在 TiS 上培养 48 h后的 CLSM结果如图 5所示，Calcein-AM 可将活细胞染色而呈绿色、PI 可将死细胞染色而呈红色（PI 染剂会被基体材料吸附）。实验结果表明，经 48 h 培养后，实验组与对照组的细胞均存活良好，仅有少量细胞死亡。相对于对照组细胞，实验组细胞均匀分布在基体上，密度较高，但 Ti6Al4V合金材料的孔隙中不存在细胞，显示出良好的贴壁细胞生长状态。

在体外细胞培养过程中，钛酸钠纳米线网状结构可促进初始细胞粘附和营养供应，有利于早期骨再生。碱处理后的多孔 Ti6Al4V 合金经过模拟体液浸泡后，表面形成的磷灰石层是一种典型的生物活性材料，可与周围骨组织发生化学键合，进一步提高其生物活性。

CCK8测试法是一种可用于细胞增殖和毒性分析等方面的生物测试方法。本研究采用CCK-8测定法评估细胞增殖。根据式（1）计算各组实验试样的细胞相对活性(Cell Vitality)。

式（1）中：OD e 为实验组 OD 值，OD b 为背景 OD 值，OD c 为对照组 OD 值，OD = lg（1/trans）。其中，OD b 为多孔板本身（未加培养基和细胞的孔）的吸光度。

由图 6 可见，TiS、TiS-A、TiS-A SBF 的细胞相对活力分别为 50.91%、52.47%、58.53%，Ti6Al4V 合金具有优良的生物相容性，表面改性处理生成了钛酸钠纳米线层，有助于提高材料生物活性；表面再经模拟体液浸泡，生物活性进一步提高，细胞相对活性由未处理前的 50.91%提高至 58.53%。

3、结论

对多孔 Ti6Al4V 合金的最佳碱热处理工艺参数进行了优化，并通过体外细胞培养实验验证了 TiS、TiS-A、TiS-A SBF 的生物学性能，得到如下结论：

1）碱热处理过程采用较低浓度碱溶液时，钛合金表面在短时间内呈现纳米网状结构，随着时间延长，纳米线直径变粗呈现团簇状；采用较高浓度碱溶液时，有利于钛酸钠纳米线迅速生长及密度增大，随着时间延长，钛酸钠纳米线聚集为纳米片状结构，中心容易形成大的孔洞，分布不均匀。

2）多孔 Ti6Al4V 合金本身具较好的生物学性能，经碱热处理后，表面形成钛酸钠纳米线涂层，细胞相对活性由 50.91%提高至 52.47%；再将碱热处理后的 Ti6Al4V 合金材料浸入 SBF 溶液中浸泡 10 d，表面会生成磷灰石涂层，此时的细胞相对活性提高至 58.53%。

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